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一、簡介
流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是一種對細胞群體中的單個細胞或類似細胞大小的顆粒進行快速、連續(xù)檢測的技術(shù)。其基本原理是：細胞或其他微粒與相應(yīng)的熒光素偶聯(lián)蛋白或抗體結(jié)合，基于層流規(guī)律的流體動力學(xué)聚焦樣本形成單細胞流，將單細胞隊列快速傳輸至激光光源與液流正交的位置時，在特定波長的發(fā)射光源激發(fā)下，形成多角度散射光和細胞攜帶的各種熒光染料被激發(fā)發(fā)出特征熒光，這些光譜能夠被機器的信號接收器接收，通過光電轉(zhuǎn)換器，將光信號轉(zhuǎn)換為電信號。儀器收集、測量眾多單細胞的散射光和熒光信號并進行關(guān)聯(lián)分析。
流式細胞術(shù)應(yīng)用廣泛，包括細胞亞群比例及濃度測定、細胞功能分型（活化、耗竭、分化時態(tài)、免疫檢查點等）、細胞功能相關(guān)實驗（細胞增殖、凋亡、周期、鈣流、殺傷、吞噬功能等）、胞內(nèi)染色（胞內(nèi)因子、核內(nèi)因子、胞內(nèi)活化激酶等）、分泌細胞因子檢測（流式液相多重蛋白定量CBA技術(shù)）、微生物學(xué)檢測（細菌、真菌、病毒等鑒定，微生物活性等）、表觀遺傳學(xué)相關(guān)檢測等。
流式細胞術(shù)檢測細胞增殖方法多樣，如相對計數(shù)、示蹤染料標(biāo)記、Brdu標(biāo)記、細胞周期、PCNA、CD71、Ki-67等方法，本文主要介紹一種臨床樣品較為適用的細胞增殖檢測方式-Ki-67檢測細胞增殖，適用于檢測的臨床樣本類型豐富，包括新鮮全血、凍存外周血單個核細胞（PBMC）、經(jīng)特殊處理的凍存全血等。
Ki-67檢測細胞增殖：
Ki-67抗原是一種與細胞增殖特異相關(guān)的核抗原，與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)，在處于細胞周期的活動期（G1、S、G2和M期）的增殖細胞中表達，在靜止G0期細胞中不表達，能夠用于判斷細胞增殖活性。此外，Ki-67在惡性腫瘤中高表達在正常細胞中幾乎檢測不到，因而逐步成為腫瘤治療中的明星靶點。
基本檢測原理：使用熒光素偶聯(lián)的抗Ki-67抗體，通過流式分析Ki-67陽性細胞的比例，反應(yīng)細胞增殖強弱。
由于健康人淋巴細胞亞群中Ki-67表達較低，直接使用健康人外周血或PBMC不益于方法開發(fā)和驗證，本文中提供一種替代的處理方式，即對健康人樣品使用刺激劑進行適當(dāng)刺激活化，獲取Ki-67陽性細胞比例相對較高的樣品用于方法建立。部分臨床試驗中使用促進淋巴細胞增殖的藥物，發(fā)揮抗腫瘤作用，對于該作用機理的方法建立可盡量選用臨床類似的處理方式，如使用臨床試驗藥物進行樣品的刺激，替代廣譜刺激劑的使用。若驗證樣品不能完全模擬臨床樣品處理情況，后續(xù)需使用臨床樣品進行部分驗證項的確認(rèn)，以確保檢測方法在臨床樣品中的適用性。
二、常用的標(biāo)本類型和處理方法
1. 人外周血：特殊采血管，適當(dāng)溫度儲存96小時穩(wěn)定，保存24小時后，樣品經(jīng)裂紅洗滌等處理后，使用細胞凍存液凍存，可于-70℃中長期保存、批量分析。檢測實驗室進行凍存處理時，對樣品運輸時效要求相對較高；臨床中心具備相關(guān)處理能力時，可節(jié)省運輸成本。
2. 外周血單個核細胞(PBMCs)：抗凝全血，分離PBMC，使用新鮮細胞進行分析或者采用合適的凍存液將細胞在-70℃或者液氮凍存，復(fù)蘇后進行試驗。臨床中心需具備分離PBMC能力。
3. 精翰生物自主開發(fā)的定制采血管，樣品采集后適當(dāng)溫度保存一定時間，可直接將樣品儲存于-70℃進行長期保存，無需凍存操作、無需程序降溫。使用該方法可節(jié)省臨床中心操作便捷性，同時，可實現(xiàn)批量運輸、批量檢測，節(jié)省項目成本。
三、實驗流程
本文闡釋通用型方法驗證相關(guān)實驗流程，即使用刺激PBMC進行Ki-67相關(guān)檢測流程。
1) 采購的新鮮PBMC，使用廣譜刺激劑刺激特定時間以獲取Ki-67陽性比例合適的樣品。
2) 刺激完成，將細胞轉(zhuǎn)至采血管中，適當(dāng)溫度保存。
3) 保存適當(dāng)時間，可直接用于檢測或取出適當(dāng)體積放于-70℃凍存，長期保存。
4) 細胞轉(zhuǎn)入流式管或者微孔板（對于凍存保存樣品需進行復(fù)蘇預(yù)處理），封閉液封閉，表面抗體孵育。
5) 固定破膜，封閉液封閉
6) 胞內(nèi)/核內(nèi)抗體孵育。
7) 上機，使用流式細胞儀進行樣品檢測。
實驗流程圖解析
四、精翰生物部分測試數(shù)據(jù)展示
1. 刺激劑刺激不同時間Ki-67陽性細胞比例變化
2. 設(shè)置的溫度保存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)（PBMC刺激48小時）
備注：以上僅為某個方法開發(fā)數(shù)據(jù)舉例，在不同細胞亞群中穩(wěn)定性結(jié)果有差別，某些項目亞群中Ki-67指標(biāo)驗證至96h穩(wěn)定性。
Ki-67分群效果圖展示（對應(yīng)表格中Baseline-DT樣品）：
3. -70℃保存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)（PBMC刺激96小時）
備注：更長時間的凍存穩(wěn)定性待測試。
五、應(yīng)用
1) 作為癌癥治療的預(yù)后指標(biāo)：越來越多臨床研究表明Ki-67可以作為癌癥治療預(yù)后評估的潛在指標(biāo)，作為預(yù)后判斷金標(biāo)準(zhǔn)，10-14%陽性比例提示有較高的預(yù)后風(fēng)險。
2) 作為癌癥治療的潛在靶點：基于Ki-67在惡性腫瘤中的高表達而在正常細胞中低表達特性，預(yù)示著其可能作為癌癥治療潛在靶標(biāo)。潛在治療方式包括Ki-67反義核苷酸，anti-Ki-67多肽核苷酸（peptide nucleic acid, PNAS），靶向Ki-67的RNA干擾技術(shù)，溶瘤病毒介導(dǎo)的Ki-67-siRNA，抑制Ki-67啟動子激活的基因治療等。
3) 作為免疫細胞激活的潛在靶標(biāo)：在抗腫瘤藥物作用機理中，部分藥物可激活機體免疫細胞發(fā)揮抗腫瘤活性，對免疫細胞增殖指標(biāo)Ki-67進行檢測，結(jié)合臨床給藥前患者基線表達情況，可用于評估藥物對免疫細胞激活情況。
參考文獻：
1、 流式細胞術(shù)-原理、操作及應(yīng)用，陳朱波、曹雪濤著，科學(xué)出版社出版。
2、 Ki67 targeted strategies for cancer therapy, C. Yang, J. Zhang, M. Ding, et al. :DOI 10.1007/s12094-017-1774-3.
