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寡核苷酸藥物（Oligonucleotide）是一類由幾十個(gè)核苷酸組成的，序列較短的核酸分子。其主要是通過基因沉默抑制靶蛋白的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)治療疾病的目的。與傳統(tǒng)藥物相比，RNA靶向藥物具有多重技術(shù)優(yōu)勢(shì)，包括：（1）靶向特異性強(qiáng)；（2）高效性；（3）藥物作用長(zhǎng)效；（4）藥物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便，研發(fā)周期短，臨床轉(zhuǎn)化與研發(fā)成功率較高；（5）候選靶點(diǎn)豐富，適應(yīng)癥分布廣等。目前人工合成的寡核苷酸藥物分類如圖1所示。其中反義寡核苷酸（ASOs）、小干擾 RNA（siRNA）為臨床中開發(fā)的RNA靶向藥物的主要形式。全球首款反義核酸藥物于1998年獲批上市，開啟RNA靶向藥物上市的征程；全球首款siRNA藥物Patisiran于2018年獲批上市，更具有里程碑意義，近兩年來已有四款siRNA藥物陸續(xù)獲批上市。截止2021年，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球已有十五款RNA靶向藥物獲批上市如圖2，有超過400個(gè)化合物處于研發(fā)階段。除Spinraza作為孤兒藥在中國(guó)獲批上市外，暫時(shí)尚無其他產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)上市。
圖1
圖2
寡核苷酸生物分析
目前寡核苷酸生物分析方法主要有HPLC、LC-MS、ELISA、RT-qPCR等，本文主要介紹基于LC-MS在寡核苷酸藥物生物分析中的應(yīng)用。
1）樣品前處理
在生物基質(zhì)中，含有復(fù)雜的成分包括蛋白質(zhì)，磷脂，大量鹽類以及其他有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)等，在使用LC-MS進(jìn)行檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生比較明顯的基質(zhì)效應(yīng)。此外寡核苷酸藥物經(jīng)過修飾后，有較高的血漿蛋白結(jié)合率，因此在樣品預(yù)處理階段去除生物樣品中的鹽和蛋白質(zhì)對(duì)于LC-MS分析的順利進(jìn)行顯得至關(guān)重要。一般寡核苷酸樣品前處理主要包括蛋白質(zhì)沉淀（PPT），液液萃取（LLE）和固相萃?。⊿PE）。PPT雖然操作簡(jiǎn)單迅速，成本低，但由于回收率低，明顯的基質(zhì)效應(yīng)，所以基本上不采用這種方式進(jìn)行前處理。一般采用LLE或者SPE，或者LLE和SPE聯(lián)合使用，可以獲得較高的回收率，同時(shí)降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。
LLE在寡核苷酸提取過程中屬于常用的一種提取方式，比較常用的萃取劑為苯酚-氯仿，在此基礎(chǔ)上也可以進(jìn)行優(yōu)化，比如加入異丙醇可以進(jìn)行沉淀，去除基質(zhì)中蛋白降低基質(zhì)效應(yīng)。同時(shí)也需要根據(jù)化合物性質(zhì)，調(diào)節(jié)pH值，比如加入氨水等，來提高寡核苷酸藥物在水相中的溶解性。另外還可以使用RNA提取試劑Trizol來提取RNA，提取過程如圖3所示。
圖3
SPE是提取寡核苷酸藥物使用最廣泛的處理方式。固相萃取的方法與色譜分離的原理相同，由于寡核苷酸藥物極性很大，保留差，在在固相小柱活化和淋洗的過程中均需要使用離子對(duì)試劑緩沖液才能達(dá)到保留寡核苷酸和洗脫干擾基質(zhì)的目的。此外目前市面上也有非常成熟的提取寡核苷藥物的試劑盒，例如Clarity?OTX?萃取方案可有效去除掩蓋目標(biāo)寡核苷酸并影響分析結(jié)果的細(xì)胞碎片，包括蛋白質(zhì)、基因組DNA和脂質(zhì)。通過去除這些污染物，MS基線噪音可顯著降低，從而簡(jiǎn)化定量生物分析的過程。SPE前處理示意圖如圖4所示。
圖4
此外寡核苷酸在聚丙烯管和玻璃容器中均存在非特異性吸附，這嚴(yán)重影響檢測(cè)重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度，因此可以加入表面活性劑或者容器烷基化來降低或者消除這一影響。
2）色譜分離
寡核苷酸屬于酸性強(qiáng)極性化合，在一般色譜柱上很難保留。針對(duì)寡核苷酸色譜法主要有離子對(duì)反相色譜（IP-RPLC）、離子交換色譜（IEC）、親水作用色譜（HILIC）。其中離子對(duì)反相色譜法最為常用，如圖5所示離子對(duì)試劑增強(qiáng)寡核苷酸在反相色譜上的保留原理主要基于兩點(diǎn)：首先，帶正電的離子對(duì)試劑會(huì)與帶負(fù)電的寡核苷酸磷酸骨架在溶液中構(gòu)成離子對(duì)，減少了寡核苷酸的凈電荷并增加了其疏水性，此時(shí)疏水相互作用促成了寡核苷酸在離子對(duì)反相色譜中的保留；再者，離子對(duì)試劑依靠其疏水性烷基鏈可以吸附于反相色譜的固定相上以形成離子交換劑（Ion exchanger），此時(shí)靜電相互作用將幫助寡核苷酸在反相色譜中的保留。
離子對(duì)試劑的種類繁多，最常用離子對(duì)主要為基于乙酸胺試劑和基于六氟異丙醇（HFIP）的胺類離子對(duì)試劑?，F(xiàn)如今，基于 HFIP的離子對(duì)試劑較基于乙酸的離子更為常用， 這是因?yàn)榕c乙酸相比，HFIP的沸點(diǎn)和酸性更弱，這意味著 HFIP 在電噴霧離子化的氣相狀態(tài)下更容易揮發(fā)，對(duì)寡核苷酸的離子化干擾更小，與電噴霧質(zhì)譜更兼容。常見的離子對(duì)試劑主要有三乙胺（TEA）、醋酸三乙胺（TEAA）、碳酸三乙胺（TEAB）、六氟異丙醇（HFIP）。如圖6整理一些關(guān)于用于反義寡核苷酸的色譜方法參數(shù)。
圖5
（The Separation and Analysis of Oligonucleotides by Mass Spectrometry，2019）
圖6
（The Separation and Analysis of Oligonucleotides by Mass Spectrometry，2019）
3）質(zhì)譜檢測(cè)
寡核苷酸由于其特殊結(jié)構(gòu)，其每個(gè)磷酸二酯鍵上都帶有1個(gè)酸性質(zhì)子（PKa~1），這類化合物在ESI源負(fù)離子模式下響應(yīng)較好。由于寡核苷酸含有多個(gè)核苷酸基團(tuán)，在ESI源中發(fā)生去質(zhì)子反應(yīng)，在負(fù)離子模式下形成多重電荷離子，同時(shí)很容易結(jié)合金屬離子，因此會(huì)分散質(zhì)譜信號(hào)。此外隨著寡核苷酸分子量增加其檢測(cè)響應(yīng)損失嚴(yán)重。因此對(duì)這類化合物需要優(yōu)化質(zhì)譜條件，改善多電荷分布，同時(shí)減少待測(cè)物在質(zhì)譜分析加合離子形成。主要通過調(diào)節(jié)溶液pH值，陽離子濃度和有機(jī)溶劑組成來消除或者降低上述因素的影響。在色譜分離中已經(jīng)提及需要使用到離子對(duì)試劑，在一開始方法開發(fā)階段，尋找子母離子也必須使用離子對(duì)試劑，否則很難找到對(duì)應(yīng)的子母離子碎片，同時(shí)基于此條件下再進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，可能會(huì)獲得比較好的信號(hào)響應(yīng)。
結(jié)束語
由于寡核苷酸藥物適應(yīng)癥涵蓋范圍廣，包括腫瘤、罕見?。∥s性脊 髓側(cè)索硬化、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、脊髓性肌萎縮）、病毒性疾病、腎臟疾病、心血管 疾?。δ懿蛔?、血脂異常等）、炎癥類疾?。ㄏ?、關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎）、代謝類疾病（糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎）等，有望掀起繼小分子化藥，抗體藥物之后第三次新藥研發(fā)浪潮。雖然其在生物分析方面存在諸多挑戰(zhàn)，但熙寧生物擁有專業(yè)的質(zhì)譜團(tuán)隊(duì)，能夠?yàn)榭蛻籼峁└鞣N解決方案，切實(shí)解決分析中的各種難題，為新藥研發(fā)貢獻(xiàn)一份力量。
